TaqMan探针荧光PCR法定量检测水中大肠埃希氏菌方法建立和应用

【摘要】目的：1．应用TaqMan探针实时荧光PCR技术(RT-qPCR)，建立大肠埃希氏菌的快速定量检测方法。2．优化水中细菌富集和DNA提取方法，以便应用RT-qPCR方法的进行水中大肠埃希氏菌的检测。3．采用RT-qPCR和多管发酵法同时检测实际水样，验证RT-qPCR方法的准确性。方法：1．根据大肠埃希氏菌的ydiJ基因，设计引物和探针，并分析其特异性和灵敏性。2．将分离的目标片断与T载体连接重组，制备大肠埃希氏菌的质粒DNA标准品。3．优化RT-qPCR反应检测体系，建立标准曲线，并进行方法学评价。4．通过比较各种水中细菌富集和DNA提取的方法，确定最佳前处理方法组合。5．采用RT-qPCR检测20份水样，所得结果与多管发酵法比较，以验证所建立方法的准确性。结果：1．引物ydiJ577的特异性实验结果表明，所有的大肠埃希氏菌和志贺氏菌标准菌株均为阳性,9株其它非大肠埃希氏菌标准菌株均为阴性;2．制备大肠埃希氏菌的质粒DNA经测序比对，结果:Identities=90/91(99%),Gaps=0/91(0%)。，标准品纯度：OD260/OD280=0.047/0.026=1.813．加标水源水经膜洗脱（L型棒洗脱法），磁珠法提取DNA，所建立的标准曲线线性范围2.3×100～2.3×106CFU/mL(R2:0.996)、检测限可达到2.3CFU/mL。4．RT-qPCR和多管发酵法检测实际水样所得结果具有相关性，r=0.991,P<0.01结论：1．RT-qPCR方法有很好的特异性，能够快速、准确地检测水中大肠埃希氏菌。2．RT-qPCR方法特别适合在中高程度污染的水样中定量检测大肠埃希氏菌。3．RT-qPCR法可以作为现行标准方法的补充，能够更加准确、及时地评价水体受粪便污染程度。
【作者】胡朝友；
【导师】傅春玲；
【作者基本信息】苏州大学，食品营养与卫生学（专业学位），2014，硕士
【关键词】水；大肠埃希氏菌；PCR；定量检测；

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